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核酸序列測定

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

DNA的堿基序列決定著基因的特性,DNA序列分析(測序,sequencing)是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴增的基因,最終均需進行核酸序列分析,可藉以了解基因的精細結(jié)構(gòu),獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜,分析基因的突變及對功能的影響,幫助人工俁成基因、設(shè)計引物,以及研究腫瘤的分子發(fā)病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等,近年來已有DNA序列自動測定儀問世。化學(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素,然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解,在電泳和自顯影后,可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑,如:2`,3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長,與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應(yīng),這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段,經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影,可讀出合成的DNA核苷酸序列,根據(jù)堿基互補原則,可推算出模板DNA分子的序列。
化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑,重復(fù)性好,容易掌握;而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶,便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運用,合成的引物容易獲得,測序技術(shù)不斷改進,故此法已被廣泛應(yīng)用。基脫氧法的自動激光熒光測序儀,使測工作更快速和簡便,而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測序,然后反推RNA序列。

 

 
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